Аналог аппарата, о котором пойдёт речь в статье, есть почти в каждом доме. Это барабан стиральной машины. Большие и маленькие центрифуги содержат в себе похожие барабаны. Они позволяют разобрать клетку на части и изучать их отдельно.
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ РАЗМЕРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Многие клетки видны только в микроскоп, а их составные части и того меньше. Что делать, если нам нужны только какие-то определённые клеточные «кирпичики», а остальные нас не интересуют? Если мы хотим просто посмотреть на отдельные органеллы, просто найдём под микроскопом нужный объект и сфокусируемся на нём.
Но если нам интересен не форма органеллы, а её состав, как тогда быть? Митохондрии, рибосомы и другие составные части клетки не вытащишь микроскопическим пинцетом и не сложишь в пробирку. И даже если появятся подходящие инструменты, всё равно потребуется много клеток, чтобы набрать нужное количество материала. Так что работа по разделению органелл останется кропотливой и долгой.
Но что, если разделять клетку на компоненты не по одному? Не вытаскивать органеллы по одной, а как бы просеять их через миниатюрное сито? Одни структуры упадут, а другие, более крупные, задержат ячейки сита. Это позволит доставать нужные части сразу из множества клеток.
Способ, отдалённо похожий на такое «сито», уже существует и называется центрифугированием. Правда, прибор для разделения органелл, центрифуга, на сито совсем не похож. В нём в роли ячеек выступает жидкость, а в ней плавают структуры клетки. Жидкость задерживает органеллы разного размера на разное количество времени. Поскольку органеллы очень маленькие, приходится помогать им упасть. При этом быстрее падают более крупные и тяжёлые части клетки — в настоящем сите было бы наоборот.
Вращающийся механизм стиральной машины выталкивает частицы грязи на внешнюю сторону барабана.
КАК РАБОТАЕТ ЦЕНТРИФУГА
Представьте себе очень-очень мелкий дождь. Настолько мелкий, что капли скорее летят вниз, чем падают на землю. Что-то похожее бывает и при снегопаде. Во время ливня с его крупными каплями и тем более во время града мы такого не увидим. Все эти капли притягивает Земля, но мелкие сильнее задерживаются воздухом. Ведь он не пустое пространство, а содержит разнообразные частицы. Соприкасаясь с нашим объектом, они тормозят его. Это явление — сопротивление среды — сильнее задерживает маленькие и лёгкие предметы, чем большие и тяжёлые.
На графике слева то, что оседает медленнее всего, справа то, что оседает быстрее всего. r эфф — эффективный радиус, измеряется обычно в сантиметрах, и чем он больше, тем более сильное ускорение (центробежную силу) развивает центрифуга при том же числе оборотов в минуту.
Чем плотнее среда, тем сильнее будет проявляться её сопротивление. Поэтому органеллы помещают в жидкость даже более плотную, чем цитоплазма. А поскольку компоненты клетки очень маленькие и падать будут крайне долго, их нужно ускорить. В этом главная задача центрифуги.
Усилить земное притяжение этот прибор не может, да это и не обязательно: никто не сказал, что частицы, которые мы хотим разделить, обязаны лететь вниз! Они могут направляться в любую сторону, главное, чтобы разные компоненты клетки перемещались с разной скоростью.
Барабан центрифуги очень быстро, тысячи раз в минуту, вращается и тем самым создаёт центробежную силу (кстати, слово «центрифуга» и означает «центробежная»). Все предметы внутри стремятся вылететь наружу, но стенки центрифуги мешают им это сделать. По такому же принципу работает отжим в стиральной машине. Только в её барабане есть отверстия для слива воды, а в центрифуге такого не предусмотрено.
В итоге содержимое барабана центрифуги отлетает к его стенкам и остаётся там. Но отлетает, как мы помним, с разной скоростью: более крупные, массивные и плотные объекты (ядра, митохондрии) — раньше; более мелкие, лёгкие и менее плотные (рибосомы, отдельные белки, ДНК и РНК) — позже. Чем легче то, что мы хотим исследовать, тем больше должна быть центробежная сила и тем быстрее придётся вращать барабан.
Ещё играет роль размер центрифуги — радиус, по которому вращаются пробирки. Чем он больше, тем больше центробежная сила (при одинаковом числе оборотов). Поэтому для выделения ядер достаточно маленьких настольных центрифуг, а мощные ультрацентрифуги, чьи барабаны делают десятки тысяч оборотов в минуту и позволяют осадить рибосомы и отдельные молекулы белков, по размеру больше похожи на шкаф.
Компоненты клетки, как и любые другие объекты, имеют массу. Но на практике удобнее считать не её, а способность к оседанию. Она зависит не только от массы, но и от плотности и формы объекта. Способность оседать измеряют в единицах Сведберга (S) в честь химика Теодора Сведберга, который и создал метод ультрацентрифугирования. Чем больше коэффициент (количество единиц) Сведберга у объекта, тем быстрее при прочих равных он оказывается в осадке при центрифугировании. Например, 80S рибосомы цитоплазмы оседают быстрее, чем 55S рибосомы митохондрий млекопитающих. Коэффициент Сведберга есть не только у органелл, но и у всех объектов, которые можно выделить из раствора с помощью центрифуги.
Конечно, органеллы не положишь в барабан центрифуги, как кладут одежду в стиральную машину. Нужно поместить их в пробирку. У центрифужных пробирок есть крышки, чтобы содержимое не выплёскивалось при остановке вращения. Эти пробирки вставляют в специальные углубления в барабане (их ещё называют гнёздами!), при этом обязательно друг напротив друга. Если какую-то пробирку не уравновесить таким образом, центрифуга будет вращаться неровно и сломается, барабан даже может вылететь из неё.
ПЕРЕД НАБОРОМ ОБОРОТОВ
Мы сказали, что компоненты клетки помещают в пробирки, прежде чем их начнёт вращать центрифуга. Но как это делают? Если в жидкость просто «насыпать» клетки, при вращении они будут оседать вместе со всеми своими органеллами, притом быстро. Никакого разделения не получится. Выходит, перед центрифугированием нужно обязательно вынуть из клеток их содержимое. Как?
Необходимо освободить органеллы от оболочек клеток. Для этого клетки придётся измельчить, а их мембраны — «разбить» на маленькие капли с помощью веществ, похожих на мыло (сами мембраны по составу похожи на жир). Конечно, какие-то их компоненты при этом пострадают, и их раздавит и разрежет, но это невысокая цена, ведь мы берём множество клеток — десятки тысяч. Их часто стараются выделить (вырезать) из какого-то одного органа, чтобы размеры органелл и их состав были близки друг другу.
Процесс измельчения и растирания тканей и клеток называется гомогенизация. Чтобы органеллы не стали переваривать сами себя, то есть чтобы им не мешали жить клеточные ферменты, температуру при гомогенизации понижают примерно до той, что в обычном холодильнике. Это дезактивирует ферменты. Ещё нужно сохранить солёность и кислотность такими же, как в живой клетке. Для этого используют буферные растворы. Буферными их называют потому, что они сдерживают изменения солёности или кислотности при изменении состава раствора. Растворы заливают в клеточную смесь, и они становятся основой гомогената — однородной смеси компонентов клеток.
Приборы для создания гомогената называют гомогенизаторами. В лабораторных гомогенизаторах часто есть ножи, а также пестики — палочки для перемалывания и перемешивания образца. Кстати, гомогенизаторы нужны не только для того, чтобы получить смесь органелл клетки. Они используются и вне науки, например, в производстве сливок и других похожих продуктов. Промышленные гомогенизаторы могут быть устроены по-другому. В них часто применяется высокое давление и газы.
Когда гомогенизатор закончил свою работу, надо убрать лишнее: осколки клеточных мембран и клеточных стенок, а также длинные белковые волокна из коллагена, которые часто находятся вне клеток. По плотности они похожи на органеллы, но обычно имеют больший размер. Поэтому гомогенат пропускают через марлю — подобно тому, как дома из прокисшего молока делают творог. Только в случае с творогом нам нужно то, что остаётся в марле, а при центрифугировании нас интересует как раз то, что всё же прошло через марлю.
ВРАЩАЙТЕ БАРАБАН
После того как гомогенат профильтрован через марлю, его можно собирать в пробирке и помещать в центрифугу. Уравновесив пробирки (то есть поставив их строго друг напротив друга, так, чтобы в двух противоположных пробирках было одинаковое количество жидкости), запускаем центрифугу. После нескольких минут вращения с определённым числом оборотов откроем центрифугу и увидим, что содержимое пробирок разделилось на две части. Одна часть — это осадок на дне. Это всегда самые крупные частицы в гомогенате. Если мы только-только начали разделять гомогенат на компоненты, то в осадок, скорее всего, попадут ядра клеток. То, что не осело на дно и осталось в жидкости, называется супернатант, дословно «то, что плавает над».
РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК ГОМОГЕНИЗАТОРОМ
Если нам нужно выделить что-то поменьше ядра, то дальше использовать нужно будет именно супернатант. Его специальной микропипеткой высасывают из центрифужной пробирки, при этом стараясь не касаться осадка. Супернатант переносят в следующую пробирку для центрифугирования.
Но на этот раз, чтобы дождаться появления осадка, нужно больше времени и больше оборотов барабана в минуту. Когда осадок перестанёт образовываться, сколько бы и как быстро мы ни крутили центрифугу, значит, в пробирке осталась только цитоплазма, разбавленная буферным раствором.
Каждый осадок при последовательном центрифугировании будет называться фракцией и содержать в себе только ограниченный набор клеточных структур. Первые фракции тяжёлые, следующие — лёгкие. Выбрав нужную фракцию, вымоем её из пробирки и будем изучать так, как нам это требуется.
Как отследить момент, когда в осадке окажутся нужные нам части клетки? Можно довериться справочникам, которые подскажут, сколько минут ждать и на каком количестве оборотов крутить центрифугу, чтобы осадить митохондрии, лизосомы и другие интересующие нас объекты. Есть и другой способ проверки. Химический состав каждого компонента клетки отличается. В каждом есть молекулы-маркёры — вещества, которые встречаются только в органеллах какого-то одного типа, а в органеллах другого типа их нет. Таким образом, если мы найдём в составе осадка вещество-маркёр митохондрий, мы можем считать, что и сами они в этом осадке тоже есть.
Заглавное изображение: Unsplash
