Бюретка, колба и весы ещё недавно были классическим набором химика-аналитика, позволяющим ему познавать тайны состава вещества. Но в последние десятилетия в химию ворвались инструментальные методы анализа с привлечением устройств исключительной чувствительности. Подобный химический хайтек сделал «зрение» учёных очень острым — ни одно соединение не уйдёт незамеченным.
Адсорбционная хроматография — очистка протеина
Вещества, входящие в состав образца, имеют разную растворимость в элюенте. Более растворимые движутся вниз по колонне с большей скоростью. Это позволяет собрать отдельные фракции в зависимости от растворимости веществ.
Михаил Цвет (1872–1919) — русский ботаник-физиолог и биохимик растений. Создал хроматографический метод. Исследовал пигменты листьев растений, получил в чистом виде хлорофиллы a, b и c.
Хроматография: разделяй и анализируй
Хлорофилл – группа сложных органических веществ. Разделить их с помощью дистилляции (перегонки жидкости) или экстракции (отделение вещества с помощью растворителя) нельзя. В первом случае хлорофилл разрушается, а чувствительность экстракции слишком низкая для такого соединения. Именно с такой проблемой столкнулся русский ботаник Михаил Цвет в начале XX века, но не поддался отчаянию. Учёный пропустил раствор хлорофилла через длинную стеклянную трубку или колонну, заполненную порошком мела. Как только хлорофилл начинал движение, ему вдогонку отправили чистый органический растворитель — петролейный эфир. У этого соединения, названного в дальнейшем элюентом, скорость движения по порошку мела значительно выше, чем у анализируемого вещества и, фактически, он занимается протягиванием компонентов через толщу мела. Разные составные части хлорофилла обладают разной адсорбционной способностью к мелу и фиксируются в разных частях колонки — в итоге соединение распадается на составные части, имеющие разные молекулярные массы, строение и цвет.
ХЛОРОФИЛЛ
Это зелёный пигмент, окрашивающий хлоропласты растений в зелёный цвет. При его участии осуществляется процесс фотосинтеза.
Так появилась хроматография (от греч. хроматос — цвет и графо — писать) — уникальный аналитический метод, сочетающий и разделение, и количественное определение веществ, входящих в сложносоставную пробу, как, например, хлорофилл.
Учёные не оставили без внимания такой замечательный аналитический инструмент и решили его автоматизировать, запустив в конце 50-х годов в массовое производство приборы хроматографы. В этой установке на выходе из хроматографической колонки специальный детектор непрерывно регистрирует свойства выходящего газа или раствора. Итоговая пиковая хроматограмма характеризует качественный состав смеси, высота и площадь каждого пика показывают количественное содержание компонентов.
За более чем шестидесятилетнюю историю, хроматографические приборы претерпели эволюционные изменения. Появились высокоэффективные жидкостные хроматографы (ВЭЖХ), в которых в качестве сорбента представлены вещества с мельчайшими частицами диаметром до 5 мкм, а сами колонки очень компактны — длиной 10–30 см. Аппарат под значительным давлением (до 400 атмосфер) подаёт анализируемое вещество в колонку, а детекторы на выходе контролируют оптическую плотность элюента или интенсивность его люминесценции. Компьютер собирает всю информацию и выдаёт химику-аналитику состав вещества, направленного на исследование. Точность уникальна — предел обнаружения компонента составляет 10–10 г
Где используют хроматографы?
Нефтехимия
В сырой нефти содержатся десятки тысяч (!) различных соединений. Аналитической лаборатории нужно определить хотя бы несколько сотен из них. Здесь и приходят на помощь хроматографические методы разных модификаций, которые позволяют составить общее впечатление от нефтяного месторождения и решить, как использовать «чёрное золото» — в качестве топлива (бензин, керосин и др.) или источника сырья для химической промышленности.
Пищевая промышленность
Сложно будет без хроматографической колонки и в пищевой промышленности. Химик-аналитик может определить токсичные примеси в спиртосодержащем сырье, наличие аммиака в биологических жидкостях, а также детектировать и выделять в чистом виде красители в продуктах питания.
Фармацевтика
Создание метаболического профиля человека на основе хроматограмм биологических жидкостей и выдыхаемого воздуха — одно из hi-tech-направлений в клинических исследованиях. В тесной связке с компьютером хроматограф способен обнаружить более сотни отдельных компонентов в продуктах метаболизма человека. Это позволяет врачу дать оценку эффективности лечения и диагностировать заболевание на самых ранних этапах.
Медицина
Закись азота N2 O — продукт трансформации нитроглицерина, спасший сотни тысяч жизней. Именно N2 O отвечает за расширение кровеносных сосудов. У закиси множество выдающихся ролей в организме (к примеру, участие в восприятии боли и процессах памяти). Это привлекает к соединению внимание врачей-исследователей со всего мира, но определить его в тканях можно только с помощью хроматографии.
Экология
Бензапирен C20H12 — вещество первого класса опасности, мощный канцероген, обладает способностью накапливаться в тканях и отличается завидной стойкостью. Бензапирен, продукт горения различных веществ, требует постоянного контроля в воздухе и сточных водах. Это дёшево и просто сделать с помощью хроматографии.
Спектрофотометр: химическое светопоглощение
Следующий прибор больше подходит не для идентификации веществ, а для количественного анализа растворов. Называется он спектрофотометр. Принцип его работы основывается на измерении оптической плотности раствора химического вещества.
Если упрощённо, то световой поток в таком приборе пронизывает кювету с анализируемой пробой, а специальный фотоэлемент преобразует пробившийся свет в электрический сигнал. Свет может быть различной природы: если нужен ультрафиолет, то применяют водородную или дейтериевую газоразрядную лампу, если, наоборот, инфракрасный спектр, тогда в ходу идут глобары — керамические стержни, нагреваемые до 1600°С. Часто в спектрофотометрах применяют обычные лампы накаливания с вольфрамовой нитью или современные диодные светильники. Излучение от источника света принимает монохроматор — наверное, важнейший элемент конструкции спектрофотометра, ответственный за расщепление излучения на спектральные составляющие. Обычно это призма или дифракционная решётка, имеющая сложное наименование — диспергирующий (расщепляющий) элемент. Для анализа растворов очень важно применять определённую длину волны, поэтому после монохроматора устанавливается выходная щель, ширина которой порой достигает крохотные доли нанометра. Сквозь неё проходит тщательно «отфильтрованная» световая волна, необходимая химикам для аналитических исследований.
Что же дальше? Оказывается, молекулы способны избирательно поглощать кванты соответствующей энергии — это своеобразная «подпись», по которой можно узнать соединения в растворе. Например, из неорганических веществ отлично определяются молекулы с d- и f-элемен тами и некоторые комплексные соединения. В ряду органических веществ определяются непредельные и ароматические УВ с их производными.
Стоп,— скажет любой школьник, прилежно изучающий химию,— а как же остальное многообразие химических веществ? Действительно, по собственному светопоглощению определяется не так много веществ, но на помощь приходят фотометрические реакции. Для этого в раствор анализируемого вещества добавляют специальный реагент, переводящий изначальный светопрозрачный раствор в светопоглощающий. Поясним на примере ионов Fe+3, концентрацию которых спектрофотометр не способен так просто определить. А несколько капель роданида калия KSCN окрасят раствор в кроваво-красный — это типичная качественная реакция из школьного учебника. Только теперь вы можете добавить к ней ещё одно определение — фотометрическая реакция! После этого спектрофотометру остаётся на основании спектра поглощения раствора определить его оптическую плотность (если проще — меру непрозрачности) и выдать на мониторе концентрацию ионов Fe+3. И делать это прибор может двумя способами: просвечивая кювету насквозь, либо анализируя отражённое от пробы излучение. Такой
замечательный метод химического анализа имеет только один значимый минус — необходимость перевода любой пробы в раствор — другими словами, анализ нельзя провести в твёрдой или газовой фазе.
Король всех методов
Ключевые научные и технологические открытия очень часто отмечаются Нобелевскими премиями и, конечно, аналитический хайтек не стал исключением. История следующего героя началась в 1919 году, когда Фрэнсис Астон под руководством Джона Джозефа Томсона создали принципиально новый тип прибора для химических исследований — масс-спектрометр. Ключевым преимуществом этого аппарата была способность обнаруживать изотопы. Уже в 1922 году Астон получил Нобелевскую премию по химии за своё детище.
Во-первых, для его работы необходим вакуум, чтобы лишние молекулы не мешали анализу. Во-вторых, проба изначально может быть любой, но в спектрометр она должна поступить исключительно в газообразном состоянии, поэтому всё твердое и жидкое необходимо предварительно испарить. Но это не последние злоключения пробы — на следующем этапе аппарат подвергает её ионизации. Для этого арсенал велик: химическая ионизация, искровой разряд, лазер, электронный удар и другие не менее изощрённые способы. В-третьих, полученные ионы необходимо ускорить и сфокусировать для отправки в масс-анализатор.
В нём под действием мощного электромагнитного поля ионы с различными массовыми числами разделяются по разным траекториям движения. Остаётся только установить качественный детектор, способный преобразовывать ионные токи в электрические сигналы. Такое чрезвычайно тонкое разделение позволило в начале XX века определять не просто отдельные элементы в пробе, а их разновидность — изотопы, отличающиеся лишь числом нейтронов! Итоговый отчёт химик-аналитик получает в виде масс-спектра, в котором каждый обнаруженный ион имеет свою линию. Стоит упомянуть, что из данного метода родился мощный инструмент для целого научного направления — геохронологии. Теперь по соотношению изотопов 12С и 13С можно определить возраст практически любого минерала или исторического экспоната.
Интересный тандем получается, если совместить хроматографию и масс-спектро метрию. Такой прибор носит сложно выговариваемое название хромато- масс-спектрометр и сочетает в себе разделение пробы на составляющие с помощью хроматографа с дальнейшим определением строения, состава, количественного состава в масс-спектрометре. Сложно? Да, и ещё недёшево. Поэтому для работы с такой техникой привлекаются только высококвалифицированные специалисты, а запускают её лишь в случаях, когда аналитическую задачу нельзя решить более простыми способами. Кстати, точность измерений масс-спектрометра рекордна — 10–12г!
Мы прикоснулись лишь к малой толике разнообразия аналитического хайтека, существующего в научном мире. Но кажется, что мир стоит только в самом начале пути, ведь для большинства исследований веществ необходимы лабора торные условия. Фантазия подсказывает — за горизонтом новые технологии, позволяющие проводить точные экспресс-анализы соединений карманными приборами.
